Lo spettrofotometro utilizza una sorgente luminosa che può generare più lunghezze d'onda e passa attraverso una serie di spettrometri per generare una sorgente luminosa con una lunghezza d'onda specifica. Dopo che la luce attraversa il campione di prova, parte della luce viene assorbita, viene calcolata l'assorbanza del campione e viene convertita la concentrazione del campione. . L'assorbanza del campione è proporzionale alla concentrazione del campione.
Quando la radiazione monocromatica passa attraverso la soluzione della sostanza misurata, la quantità assorbita dalla sostanza è proporzionale alla concentrazione della sostanza e allo spessore dello strato liquido (lunghezza del percorso ottico). La relazione è la seguente:
A = -lg (I / I0) = - = LGT KLC
Dove: A è l'assorbanza;
I0 è l'intensità della luce monocromatica incidente;
I è l'intensità della luce monocromatica trasmessa;
T è la trasmittanza del materiale;
k è il coefficiente di assorbimento molare;
L è la lunghezza del percorso del materiale da analizzare, ovvero la lunghezza laterale della cuvetta;
c è la concentrazione della sostanza;
La lunghezza d'onda di assorbimento selettivo della luce di una sostanza e il corrispondente coefficiente di assorbimento sono le costanti fisiche della sostanza. Quando è noto il coefficiente di assorbimento di una sostanza pura in determinate condizioni, il campione può essere formulato in una soluzione nelle stesse condizioni e l'assorbanza può essere determinata. Il contenuto della sostanza nel campione di prova può essere calcolato dalla formula precedente. Nella regione di luce visibile, fatta eccezione per l'assorbimento della luce da parte di alcune sostanze, molte sostanze non vengono assorbite da sole ma possono essere aggiunte sotto una determinata condizione o elaborate per renderle colorabili. È anche chiamato analisi colorimetrica. A causa del fatto che ci sono molti fattori che influenzano la profondità del colore durante la colorazione e vengono spesso utilizzati strumenti con scarsa purezza di luce monocromatica, per la misurazione simultanea vengono utilizzati prodotti standard o materiali di riferimento.
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