Quantificazione colorimetrica proteica spettrofotometrica
Le proteine sono solitamente una miscela di proteine. Le analisi colorimetriche sono basate su costituenti proteici: gli amminoacidi (ad es. Tirosina, serina) reagiscono con un gruppo cromogeno o colorante aggiuntivo per produrre un materiale colorato. La concentrazione del materiale colorato è direttamente correlata al numero di aminoacidi che la proteina reagisce, riflettendo così la concentrazione proteica.
Metodo colorimetrico
Esistono diversi metodi come BCA, Bradford e Lowry.
Il metodo Lowry: basato sulla prima reazione di Biuret e migliorato. La proteina reagisce con Cu2 per produrre una reazione blu. Tuttavia, il metodo Lowry è più sensibile di Biuret. Lo svantaggio è la necessità di aggiungere sequenzialmente diversi reagenti; la reazione richiede molto tempo; è suscettibile alle sostanze non proteiche; le proteine contenenti EDTA, Triton x-100 e ammoniaca solfato non sono adatte per questo metodo.
Saggio acido bicinconininergico: si tratta di un test proteico più nuovo e più sensibile. La proteina da analizzare reagisce con Cu2 in una soluzione alcalina per produrre Cu, che forma un chelato con BCA per formare un composto viola con un picco di assorbimento a 562 nm. La relazione lineare tra la concentrazione di questo composto e la proteina è forte e il composto formato dopo la reazione è molto stabile. Relativo al metodo Lowry, l'operazione è semplice e la sensibilità è alta. Tuttavia, simile al metodo Lowry, è suscettibile alle interferenze con proteine e detergenti.
Il metodo Bradford: il principio di questo metodo è che la proteina reagisce con Coomassie Brilliant Blue per produrre un composto colorato che assorbe a 595 nm. La sua più grande caratteristica è la sua sensibilità, che è 2 volte quella di Lowry e BCA. È più semplice e veloce. Richiede solo un tipo di reagente di reazione. Il composto può essere stabile per 1 ora per facilitare il risultato; Interferendo con Lowry, BCA reagisce con agenti riducenti (ad es. DTT, mercaptoetanolo) compatibili. Tuttavia, è ancora sensibile ai detergenti. Lo svantaggio principale è che standard diversi possono portare a grandi differenze nei risultati dello stesso campione e nessun risultato comparabile.
Alcuni ricercatori che sono esposti a misurazioni colorimetriche per la prima volta possono essere confusi dai risultati dei vari test colorimetrici. Che tipo di metodi credi di essere confuso? A causa del fatto che i gruppi hanno reagito in modi diversi e i gruppi cromogenici non sono gli stessi, vengono utilizzati diversi metodi simultaneamente per rendere incoerenti le concentrazioni del campione dello stesso campione. Ad esempio, Keller et al. testò la proteina nel latte umano e scoprì che le concentrazioni misurate da Lowry e BCA erano significativamente più alte di quelle di Bradford. La differenza era significativa. Anche se viene determinato lo stesso campione, il campione standard selezionato con lo stesso metodo colorimetrico è incoerente e anche la concentrazione dopo il test è incoerente. Ad esempio, utilizzare Lowry per testare la proteina nell'omogenato di cellule, utilizzando la BSA come standard, con una concentrazione di 1,34 mg / ml e una globulina come standard con una concentrazione di 2,64 mg / ml. Pertanto, prima di selezionare un metodo colorimetrico, è preferibile fare riferimento alla composizione chimica del campione da testare e trovare una proteina standard chimicamente simile come standard. Inoltre, il metodo colorimetrico per quantificare le proteine spesso causa problemi in quanto il valore di assorbanza del campione è troppo basso, risultando in una grande differenza tra la concentrazione del campione misurato e la concentrazione effettiva. Il problema chiave è che il colore della parte importante dello spettrofotometro 1011, la cuvetta, ha una certa emivita, quindi ogni metodo colorimetrico elenca il tempo del test di reazione. Tutti i campioni (compresi i campioni standard) devono essere testati entro questo tempo. Se il tempo è troppo lungo, il valore di assorbanza ottenuto diventa più piccolo e il valore di concentrazione convertito diminuisce. Inoltre, la temperatura di reazione, il valore pH della soluzione, ecc. Sono tutti fattori importanti che influenzano l'esperimento. Inoltre, è molto importante usare la colorimetria plastica. Evitare l'uso di cuvette in quarzo o vetro perché il colore dopo la reazione farà colorare il quarzo o il vetro, causando un'assorbanza inaccurata del campione.
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