Introduzione al principio e all'applicazione dei componenti generali dello spettrofotometro

Lo spettrofotometro è ampiamente utilizzato nella ricerca biologica, chimica, clinica e ambientale.
La spettrofotometria misura la quantità di luce che una sostanza chimica può assorbire facendo passare un raggio di luce attraverso un campione in uno spettrofotometro.
Misurando l'intensità della luce rilevata, è possibile utilizzare il metodo per determinare la concentrazione di soluto nel campione.
Il concetto di spettrofotometria
Il raggio inviato al campione è costituito da un fascio di fotoni.
Quando i fotoni incontrano le molecole nel campione, le molecole possono assorbirne alcune, ridurre il numero di fotoni nel raggio e ridurre l'intensità del segnale di rilevazione.
La trasmittanza fa parte della luce che passa attraverso il campione. È definito come l'intensità della luce che passa attraverso il campione all'intensità della luce incidente.
L'assorbanza è opposta alla trasmittanza, corrispondente alla quantità misurata dallo spettrofotometro.
Secondo l'assorbanza, la concentrazione del campione di soluzione può essere determinata dalla legge di Bill Lambert, che mostra che esiste una relazione lineare tra l'assorbanza e la concentrazione del campione. Secondo la legge Lambert sulla birra, l'assorbanza è il prodotto del coefficiente di assorbimento, che è una misura della quantità di luce assorbita dal soluto a una determinata lunghezza d'onda e la distanza attraverso la quale passa la luce. Distanza del campione o della corsa e concentrazione del soluto. In generale, l'obiettivo della misurazione dell'assorbanza è misurare la concentrazione del campione.
Componenti dello spettrofotometro
Ogni spettrofotometro è costituito da una sorgente luminosa, un collimatore (lente o dispositivo di messa a fuoco per la trasmissione di fasci forti e diritti), un monocromatore per la separazione di fasci di diverse lunghezze d'onda e un selettore di lunghezza per la selezione dell'onda o della scanalatura della lunghezza d'onda desiderata. La lunghezza d'onda della luce utilizzata nello spettrofotometro presentato in questo video è nell'intervallo di luce ultravioletta e visibile. Lo spettrofotometro include anche un supporto per campioni, un fotorilevatore e uno schermo che mostra i risultati del rivelatore.
Lo spettrofotometro più recente è direttamente accoppiato a un computer, dove è possibile controllare i parametri sperimentali e visualizzare i risultati.
Principio di funzionamento dello spettrofotometro
Quando si esegue la spettrofotometria, è importante prendere le precauzioni appropriate, come indossare i guanti, a seconda del tipo di soluzione biologica o chimica che si utilizza.
Accendere il dispositivo e consentire alla lampada e all'elettronica di riscaldarsi prima di misurare lo spettro UV-Vis del campione.
Preparare un campione bianco della stessa soluzione con lo stesso pH e resistenza ionica simile, ma senza i componenti da analizzare; poiché la cuvetta e il solvente possono disperdere la luce, è necessario analizzare il campione.
Il tradizionale supporto per spettrofotometro è progettato per contenere ciotole in plastica e quarzo. Pipettare la soluzione originale in una ciotola.
Dopo aver rimosso eventuali impronte digitali e averle spruzzate all'esterno del contenitore, inserire correttamente la cuvetta nel supporto del campione e chiudere lo sportello del coperchio.
Non dimenticare di chiudere la porta perché le radiazioni UV di uno spettrofotometro aperto possono danneggiare gli occhi e la pelle.
Programmare la lunghezza d'onda o l'intervallo di lunghezze d'onda desiderati che verranno trasmessi al campione. Ciò dipende dalla migliore lunghezza d'onda che il componente analizzato può assorbire. La macchina viene quindi azzerata misurando il campione bianco, che sottrae l'assorbanza inferiore a causa del buffer del campione.
A seconda del tipo di esperimento di spettrofotometria che si sta eseguendo, potrebbe essere necessario generare una curva standard prima della misurazione del campione, dalla quale è possibile determinare la concentrazione del composto analizzato nel campione.
Consentire al campione di raggiungere la temperatura corretta e mescolare delicatamente per evitare l'introduzione di bolle. Il campione può quindi essere aggiunto direttamente al contenitore all'interno della macchina e si può effettuare una lettura.
Dopo che il campione è stato misurato per l'assorbanza, l'esperimento viene calcolato correttamente; ad esempio, per determinare la concentrazione o il livello di attività dell'enzima.
Applicazione dello spettrofotometro
Uno degli usi comuni dello spettrofotometro è misurare la densità cellulare. La misurazione della densità cellulare può essere utilizzata per produrre la curva di crescita logaritmica dei batteri, da cui è possibile determinare il tempo ottimale per l'integrazione delle proteine ​​ricombinanti.
Lo spettrofotometro può anche essere utilizzato per misurare la velocità di reazione chimica. In questa forma di realizzazione, l'assorbanza viene utilizzata per monitorare la reazione enzimatica, che scompare nel tempo attraverso una reazione intermedia di 452 nm. La velocità di questo passaggio enzimatico può essere calcolata abbinando i dati con l'equazione appropriata.
L'introduzione del micro spettrofotometro elimina la necessità del supporto del campione. Questi spettrofotometri usano la tensione superficiale per mantenere il campione.
Il microspettrofotometro è la scelta migliore per misurare la massa e la concentrazione di campioni piccoli e costosi, come le biomolecole, comprese le proteine ​​e gli acidi nucleici.
L'assorbanza delle proteine ​​a 280 nm dipende dal contenuto di catene laterali aromatiche presenti nel triptofano, tirosina e fenilalanina, nonché dal legame disolfuro tra le due cisteine.
La concentrazione di proteine ​​può essere determinata dalla sua assorbanza a 280 nm e dal suo coefficiente di assorbimento, che si basa sulla composizione degli aminoacidi.
Il DNA e l'RNA hanno la massima assorbanza a 260 nm, da cui possono essere determinate le loro concentrazioni. La purezza degli acidi nucleici può anche essere valutata dal rapporto tra letture di assorbanza e lunghezze d'onda specifiche.